ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИИ В ПОВРЕЖДЕНИИ И ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ

В. А. Зуев¹, И. В. Викторов², Н. П. Бородина¹, Н. Г. Игнатова¹, С. И. Быковская¹, А. С. Халанский³

1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва ^Институт мозга РАМН, ³ЭНИИ морфологии человека РАМН, Москва

Открытие в начале 80-х гг. нашего столетия инфекционных прионных белков поставило на твердую этиологическую основу особую группу медленных инфекций человека и животных, известных под названием «трансмиссивные губкообразные энцефалопатии» (ТГЭ). Оказалось, что и ТГЭ человека (болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, смертельная семейная бессонница) и ТГЭ животных (скрепи, трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь оленей и лосей, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, губкообразная энцефалопатия кошек, губкообразная энцефалопатия экзотических копытных) вызывают безнуклеиновые низкомолекулярные белки, инфекционные свойства которых сочетаются с высокой устойчивостью к УФ-свету, проникающей радиации, повышенной температуре и переваривающему действию протеазы К. Такие белки получили наименование «инфекционные прионные белки» [1].

Как оказалось, инфекционный прионный белок (PrP^Sc) является производным от его нормальной клеточной изоформы, обозначенной как РгР^с. Последний играет важную роль в жизнедеятельности организма, участвуя в процессе передачи нервных импульсов в синапсах, а главное — в поддержании так называемых «циркадианных» (околосуточных) ритмов в клетке, в органе и в организме в целом. Синтез белка РгР^с продолжается в течение всей жизни и наиболее высокие концентрации и-РНК для этого белка обнаруживаются в нейронах, астроцитах и олигодендроцитах [2,3]. Нарушение синтеза РгР^с влечет за собой глубокие нарушения в мозге, особенно в таламической области, и выражаются в прогрессирующем сокращении продолжительности сна, что в конечном итоге и составляет главный признак смертельной семейной бессонницы (ССБ), которая, как всякая прионная болезнь, заканчивается смертельным исходом. Ген, кодирующий РгР^с, расположен в коротком плече хромосомы 20 у человека и хромосомы 2 у мыши [1].

Конверсия РгР^с в PrP^Sc представляет собой посттрансляционный процесс, включающий глубокие конформационные изменения, которые и являются фундаментальным событием, лежащим в основе размножения инфекционных прионов. В этом случае речь идет об изменении третичной или даже четвертичной структуры исходного клеточного белка РгР^с. Таким образом, процесс накопления инфекционного прионного белка происходит не в результате синтеза в зараженном организме новых молекул PrP^Sc, а вследствие конформационных изменений уже синтезированных нормальных молекул РгР^с под влиянием молекул инфекционного прионного белка PrP^Sc [1].

Абсолютная доказанность накопления инфекционных прионных белков в организме при всех четырех ТГЭ у человека и при всех шести ТГЭ у животных позволила именовать эти смертельные страдания как «прионные болезни» [4]. Сами прионные болезни также весьма существенно отличаются от всех известных инфекционных заболеваний тем, что они могут проявляться и как спорадические, и как наследственные, и как инфекционные. Хорошим примером этому служит болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), при которой из 100 % заболевающих в 85 % случаев болезнь возникает как спорадическая у людей 40-69-летнего возраста; в 10-15 % случаев — как наследственное заболевание и менее, чем в 1-5 % случаев эта болезнь развивается как инфекционная, т. е. в результате типичного внешнего заражения, связанного с медицинскими манипуляциями или пересадками тканевых материалов от человека к человеку (ятрогенные случаи заболевания) [5].

Все без исключения прионные болезни человека и животных отличаются характерными патогистологическими изменениями, затрагивающими лишь головной, а иногда и спинной мозг. Они проявляются в выпадении нейронов, формировании губкообразного состояния в белом и/или сером веществе головного, а иногда и спинного мозга, с образованием амилоидных бляшек и глиозом. При различных прионных заболеваниях соотношение этих признаков подвержено заметным колебаниям. Так, например, при БКЯ амилоидные бляшки встречаются в 9 % случаев, а при куру они наблюдаются в 70 %. Однако такой признак, как глиоз отмечается всеми авторами практически постоянно во всех случаях заболеваний и даже при ССБ, при которой порой бывает нелегко обнаружить признаки спонгиоза, но при микроскопическом исследовании медиодорзального и передневентрального ядер таламуса на первый план всегда выступают потеря нейронов и астроглиоз [6, 7].

На протяжении многих лет изучения повреждений центральной нервной системы (ЦНС) при прионных болезнях интерес исследователей, как правило, сосредоточивался вокруг таких вопросов, как природа и химизм бляшек, их топография, равно как и топография формирования участков спонгиоза, механизм гибели нейронов, связь характера и особенностей повреждения в ЦНС с характером мутационных изменений в гене PRNP. Вместе с тем, казалось само собой разумеющимся, что последовательность патогистологических изменений в мозговой ткани должна подчиняться общебиологической логике, когда наблюдаемый процесс выпадения нейронов рассматривается в качестве изначального признака проявления патологии, вслед за которым начинается формирование спонгиоза и отложение амилоида. Замыкать все эти события должна реакция глиозной ткани, как бы призванная замещать дефекты, возникающие в результате все увеличивающейся гибели нейронов [8].

Однако в последние годы наметился определенный интерес к роли глии в этом многоэтапном процессе повреждения клеток ЦНС под действием инфекционного и не только инфекционного белка. Так, начиная с конца 80-х гг. нашего столетия иммуноцитохимическими и ультраструктурными исследованиями было показано, что элементы глии оказываются вовлеченными в процесс фагоцитоза амилоидных фибрилл при болезни Альцгеймера (БА) [9,10], с одной стороны, а с другой — они способны принимать непосредственное участие в формировании амилоидных фибрилл при экспериментальной БКЯ и при БА [11, 12]. Позднее эти данные были подтверждены, когда обнаружилась активированная микроглия при экспериментальной скрепи у мышей, участвующая в процессе отложения амилоида [13]. Тогда же в лаборатории К. Гайдушека была экспериментально продемонстрирована вариабельная, но важная роль микроглии в процессе образования амилоидных бляшек при прионных болезнях и высказано мнение, что наблюдаемая вариабельность отражает специфическую связь ее с данной нозологической формой и реализуется на уровне синтеза и-РНК для белка-предшественника скрепиассоциированного амилоида [14].

Недавно эти исследования получили неожиданное продолжение в ряде работ, посвященных изучению механизмов смерти нейронов. Прежде всего было показано, что синтетический пептид 106-126, гомологичный по своим последовательностям амилоидному белку, выделенному из мозговой ткани пациента, погибшего от синдрома Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (СГШШ), при внесении в культуру нейронов и астроцитов вызывает гибель первых по типу апоптоза и выраженную пролиферацию и гипертрофию — вторых [15]. Более того, указанный выше пептид 106-126, как оказалось, способствует формированию амилоидных фибрилл в условиях in vitro и является токсичным для культуры нейронов только при условии одновременного присутствия микроглии, которая отвечает на присутствие пептида 106-126 повышением в ней содержания окислительных радикалов [16].

Прямой анализ последовательности событий в мозге при скрепи у мышей показал, что активация глии и последующая иммунореактивность цитокинов в ходе развития болезни наступает значительно раньше, чем развитие спонгиоза. Начало продукции цитокинов, активированной глией, предшествует процессу апоптоза нейронов [17]. Сходные события были описаны несколько ранее при БА, когда было выявлено иммуноареактивное воздействие глии на такие цитокины, как ИЛ-1, ИЛ-6 и связанный с ними процесс накопления амилоидных бляшек [18]. Поэтому высказывается предположение о том, что при скрепи, равно как и при БА, процесс выпадения нейронов опосредован продуктами активации глии [19, 20].

Наконец, еще один довольно своеобразный подход также подтверждал важную роль глии в прионной патологии. Так, R. Demaimay и соавт. [21], обрабатывая зараженных скрепи мышей амфотерицином В или его менее токсичным дериватом, показали, что увеличение продолжительности жизни животных под действием препаратов сопровождалось замедлением отложения в мозговой ткани PrP^sc, что сочеталось со снижением гиперэкспрессии специфического для астроцитов кислого глиального фибриллярного белка.

Почти 30 лет назад начало формироваться мнение о весьма выраженном сходстве мозговых нарушений в процессе старения с мозговыми изменениями при ТГЭ. И главной отправной точкой при этом оказались уже упомянутые выше патоморфологические находки при ТГЭ. Строгое единообразие этих изменений, наблюдаемых, например, в организме зараженных скрепи мышей, не могло не обратить внимания исследователей на их поразительное сходство с патогистологическими изменениями в организме стареющих мышей. Между тем, еще в 1970 г. было установлено, что в организме стареющих мышей ткань мозга характеризуется гибелью нервных клеток, разрастанием глии и формированием амилоидных бляшек. Вскоре подобные же изменения были описаны и в ткани мозга старых собак, и обезьян [22]. С течением времени изменения в тканях мозга, напоминающие черты патогистологии при куру, БКЯ, СГШШ, были выявлены в мозге людей, страдающих БА, старческим слабоумием и даже у внешне здоровых пожилых людей [23, 24].

Не вдаваясь в анализ уже достаточно многочисленной литературы, заметим лишь, что сходство в картине повреждений мозга при старении и при прионных болезнях дает основание предполагать важную роль элементов глии в первом случае, как это все более убедительно демонстрируется во втором. Тем более, что ген, кодирующий синтез предшественника амилоида при БА, естественном старении и болезни Дауна, является единственным, детерминирующим синтез этого соединения и он, как и прионный ген, высоко консервативен и каптирован [25].

Именно поэтому нами высказывается предположение о возможном накоплении в мозговой ткани стареющих млекопитающих, включая и человека, какого-то фактора (или факторов), активно стимулирующего пролиферацию глии, что может послужить существенным элементом в генезе морфологических изменений, включая нарушение трофики нейронов, которое, в свою очередь, может послужить причиной их гибели и в конечном счете причиной гибели мозга в целом.

Приступая к экспериментальной проверке высказанного предположения, мы на первом этапе исследований поставили целью проанализировать в условиях клеточных культур возможность накопления в стареющем мозге млекопитающих фактора, способного стимулировать пролиферацию глии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура первично-трипсинизированных глиальных клеток. Измельченный головной мозг 3-5-дневных мышей линии C57BL/6 помещали в 0,25 % раствор трипсина при 37°С на 10 минут, после чего клетки осаждали центрифугированием, трижды отмывали в среде Игла Д-МЕМ, а затем пипетировали в ростовой среде следующего состава: среда Игла Д-МЕМ+глютамин (3 %)+ эмбриональная телячья сыворотка (10 %)+ +HEPES (1 %)+ антибиотики.

10-дневный монослой глиальных клеток перевивали по общепринятой методике с помощью 0,2 % раствора версена. Исходная концентрация клеток в суспензии составляла 200 тыс./мл. Диссоциированные глиальные клетки культивировали в пробирках Лейтона на покровных стеклах в той же среде с добавлением стерильного экстракта мозга мышей. Снятие клеток со стекол осуществляли с помощью 0,2 % раствора версена и их количество подсчитывали в камере Горяева.

Перевиваемые линии клеток. Использовали линии ЭПНТ-5 (эпендимобластома мыши) и НГУК-2 (невринома Гассерова узла крысы), любезно предоставленные А. С. Халанским (НИИ морфологии человека РАМН). Клетки культивировали в ростовой среде вышеописанного состава по общепринятой методике.

Приготовление мозговых экстрактов. 25 % экстракты мозга мышей получали путем растирания мозговой ткани мышей с электрокорундом в фарфоровой ступке в присутствии 3 частей ростовой среды (см. выше). Суспензию осветляли центрифугированием при 3 тыс. об./мин в течение 10 минут. Над осадочную жидкость пропускали через фильтры Millipor (0,45 мк). В опытах использовали экстракты, полученные из мозговой ткани 2-месячных (молодой мозг) и 1 5-го-довалых (старый мозг) мышей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В первой серии опытов испытывали стимулирующий эффект предварительно разведенных до 1:50 мозговых экстрактов, полученных от мышей разного возраста, на пролиферацию первично-трипсинизированных глиальных клеток Для этого весь пул пробирок с культурами делили на три части, первая из которых служила контролем, во вторую часть пробирок добавляли экстракт молодого мозга и в третью — экстракт старого мозга (табл. 1).

Таблица 1. Стимуляция пролиферации первично-трипсинизированных глиальных клеток мозга мышей мозговыми экстрактами мышей различного возраста

Сутки	0	8	11	14
Контрольные (без экстракта)	200	110+9,6	150+17,1	316+29,2
С добавлением экстракта молодого мозга	200	275+11,3	183+13,7	366+18,6
С добавлением экстракта старого мозга	200	450+12,4	800+31,1	741+19,7

Как видно из данных табл. 1, экстракты молодого мозга оказывали слабый (менее чем двукратный) стимулирующий эффект на пролиферацию глиальных клеток и то лишь регистрируемый к 14-му дню наблюдения. Вместе с тем, использование экстракта старого мозга приводило к значительной стимуляции пролиферативной активности глиальных клеток и уже к 8-му дню достигало более чем двукратной величины. Дальнейшее наблюдение и подсчеты клеток показали, что к 11-14-му дню стимулирующий эффект достигал 3-4-кратных величин.

Обнаруженный в опытах заметный эффект стимуляции пролиферативной активности первично-трипсинизированных глиальных клеток экстрактом, полученным из мозговой ткани старых мышей, дал основание для проверки возможного существования подобного же эффекта и при использовании перевиваемых клеточных линий различного происхождения. В этой серии опытов использовали мозговые экстрактам в разведениях 1:40, 1:200 и 1:400. Начальная концентрация клеток соответствовала 50 тыс/мл, время наблюдения ограничивалось 6 днями. Действие мозговых экстрактов испытывали на двух линиях¹ перевиваемых клеток, одна из которых была мышиного происхождения (ЭПТМ-5), а другая — (НГУК-2) — получена от крысы (табл. 2 и 3).

Таблица 2. Стимулирующий эффект мозговых экстрактов молодых мышей на

пролиферацию клеток линии ЭПНТ-5 и НГУК-2

ЭПНТ-5 НГУК-2

Линия клеток	Время культивирования (часы)	Контроль (без экстракта)*	Разведения экстракта молодого мозга
			1:40	1:200	1:400
	0	50	50	50	50
	24	61±7,1	65±6,3	81±11,1	117±4,9
	72	115±4,3	9б±6,7	87±5,6	55±3,6
	144	198±6,9	155±5,8	83±7,1	107±9,5
	0	50	50	50	50
	24	108±3,5	106±5,2	108±7.2	91±6,2
	72	76±6,9	78±4,3	76±5,9	174±8,5
	144	319±7,1	291±8,2	80±3,6	170±7,1

Таблица 3. Стимулирующий эффект мозговых экстрактов старых мышей на пролиферацию клеток линий ЭПНТ-5 и НГУК-2

ЭПНТ-5 НГУК-2

Линия клеток	Время культивирования (часы)	Разведения экстракта старого мозга
		1:40	1:200	1:400
	0	50	50	50
	24	219±6,4	144±3,7	80±2,9
	72	644±12,4	229±6,7	31±4,2
	144	1661±25,1	352±4,8	211±6,1
	0	50	50	50
	24	201±9,7	58±7,9	166±10Д
	72	222±9,6	213±8,7	118±7,6
	144	1744±19,9	167±8,0	89±4,3

* контрольные культуры, культуры с добавлением экстрактов молодого и старого мозга исследовались одновременно. Разделение данных в две таблицы условно.

Как видно из данных табл. 2, экстракт молодого мозга даже в наивысшей концентрации 1:40, как правило, не оказывает стимулирующего действия на клеточную пролиферацию в обеих линиях, и к 144-му часу концентрация клеток либо соответствовала таковым в контроле, либо (при использовании экстрактов в больших разведениях) оказывалась даже несколько ниже контрольных величин.

Экстракт старого мозга в разведениях 1:200 и 1:400 оказывал примерно сходный эффект в обеих культурах, когда концентрации клеток не превышали контрольных показателей или превышали их незначительно (табл. 3). В то же время более высокие концентрации этих экстрактов (разведения 1:40) оказывали резко выраженный стимулирующий пролиферацию эффект. Так, в культурах мышиных клеток ЭПТМ-5 клеточная концентрация к 144-му часу увеличивалась более, чем в 8,3 раза по сравнению с концентрацией клеток в контроле. В то же время аналогичный показатель в культуре НГУК-2 соответствовал 5,5 раза. Интересно, что и в той и в другой культуре количество клеток под влиянием экстрактов старого мозга увеличивалось по сравнению с их исходными концентрациями более, чем в 33 раза в культурах ЭПТМ-5 и почти в 35 раз — в культурах НГУК-2.

Полученные данные, по-видимому, дают основание для продолжения исследований и подразумевают в первую очередь фракционирование мозговых экстрактов с тем, чтобы попытаться получить, по возможности, очищенный фактор, столь активно стимулирующий пролиферацию как глиальных клеток, так особенно и клеток в перевиваемых линиях. Достижение этой цели поможет, во-первых, приблизиться к пониманию природы предполагаемого фактора и, во-вторых, даст основание для проведения опытов на животных.

В заключении хотелось бы еще раз напомнить, что 17 лет, прошедшие с момента открытия прионов, знаменовались не только окончательным торжеством прионной теории, не только присуждением ее автору — Стенли Прузинеру — Нобелевской премии, но и все укрепляющимся представлением о существовании в организме белков, способных в результате конформационных изменений своей третичной структуры принципиально менять свои свойства. Вот почему сегодня в литературе все чаще употребляется понятие «конформационные болезни» [26], когда конститутивные белки, подвергаясь изменениям по размеру или форме, из жизненно необходимых могут превратиться в смертельно опасных, вызывающих тяжелые, а порой и фатальные расстройства.

Литература

1. Prusiner S. В. — In: Neurodegenerative diseases. Eds. G. Jolls & J. M. Stutzmann Acad Press. -1996. — P. 23-80.

2. Moser M., ColelloR. J., PottU. et al. — Neuron. -1995. — Vol. 14. — P. 509-517.

3. Manson J. — In: Transmissible subacute spongif orm encephalopathies: prion diseases. Eds. L. Court & B. Dodet. — Elsevier. — Paris. -1996. — P. 239-245.

4. Palmer M., Collinge J. — In: Prion diseases. Eds. J. Collinge & M. Palmer. Oxford Univers Press. — 1997. — P. 1-17.

5. Collinge J., Palmer M. — Ibid. — P. 18-56.

6. Ironside J., BellJ. — Ibid. — P. 57-88.

7. Seilhean D., Lazarini F., Duyckerts C. et al. — in: transmissible subacute spongif orm encephalopathies: prion diseases. Eds. L. Court &B. Dodet. Elsvier. Paris -1996 — P 421-423.

8. Зуев В. А. — Медленные вирусные инфекции человека и животных. — М. Медицина 1988. — С. 151-201.

9. Itagaki S., McGeer P. L., Akiyama H. et al. — J. Neuroimmunol. -1989. — VoL 2 — P.173-182.

10. Wisniewski H. M., Barcikowska M., KidaE. — ActaNeuropathol. -1991. — Vol 81 — P.588-590.

11. Hikita K., Tateischi J, Nagara H. — ActaNeuropathol. (Berlin). -1985. — Vol 68 — P.138-144.

12. WisniewskiH. M., Verbrodt A. W., Moretz R. C. et al. — Exp. Brain Res. (Suppl.). -1982 — VoL 5. — P. 3-9.

13. Beck E., Daniel P. M. — In: Prions. Eds. S. Prusmer & M. P. McKinley. Acad. Press. — N Y -1987. — P. 331-385.

14. Guiroy D. C., Wakayama I., Liberski P. et al. — Acta Neurol. -1994. Vol. 87. — P. 526-530.

15. Taglivani F., Prell F., Salmona M. et al. — In: Transmissible subacute spongiform encephalopathies. Eds. L. Court & B. Dodet. Elsvier. Paris. -1996. — P. 323-327.

16. Brown D. R., SchmidtB., Kretzschmar H. A, — Nature. -1996. — Vol. -380. — P. 345-347.

17. Williams A., Van Dam A. M., Lucassen P. L- Intransmissible subacute spongiform encephalopathies. Eds. L. Court &B. Dodet. Elsvier. Paris. -1996. — P.167-171.

18. Gray C. W. Patel A. L-Mol. Brain Res. -1993. — Vol. 19. — P. 251-256.

19. W. EikelenboomP., ZhanS. S., Van GoolW. A. etal. — Trends Neurosci. 1994 — Vol 15 — P 447-450.

20. Bruce M. E., McBridge P. A., Jeffrey M. et al. — In: Alzheimers disease: advances in clinical and basic research. — N. Y. -1993. — P.481-487.

21. Damaimay R., Adjou К. Т., Beringue V. et al. — In: Transmissible subacute spongiform encephalopathies. Eds. L. Court &B. Dodet. Elsvier. Paris. -1996. — P.191 -197.

22. Sobel H. — Цит. по В. А. Зуев — Медленные вирусные инфекции человека и животных. М., Медицина. -1988. — С. 233 — 234.

23. Masters С. L., Multhaup G., Simms G. et al. — EMBO J. -1985. — Vol. 4. — P. 2757-2763. 1- Fraser H., McBride P. A. — In: Senile dementia of the Alzheimer type. Eds. J. Traber &

W. H. Gispen. Berlm-Heidelberg. -1985. — P. 250-268.

25. Goldgaber D., Lerman M. L, VcBride W. 0. et al. — J. Nrural. Transm. -1987. — Vol. 24. — P.23-28.

26. CarrellR. W., LomasD. A. — Lancet. -1997. — Vol. 350. — P. 134-138.