ОПИАТНАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМОРАЛЬНОГО ФАКТОРА КОСТНОГО МОЗГА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРОДУКЦИЮ АНТИТЕЛ
Р. В. Петров, М. Е. Вартанян, А. А. Зозуля, Э. Пацакова, Я. В. Каст, Л. А. Захарова, А. М. Михайлова (1983)
Гуморальный фактор костного мозга, стимулирующий продукцию антител (САП), является одним из медиаторов иммунной системы, регулирующих антителогенез. Он вырабатывается клетками костного мозга в процессе нормального метаболизма и усиливает антителообразование в момент максимального развития иммунной реакции. Данный медиатор изолирован из надосадочной жидкости культур клеток костного мозга различных видов животных и охарактеризован. Он представляет собой рибонуклеопротеид с молекулярной массой около 13 000 дальтон.
В последнее время было показано, что САП не только выполняет иммунорегуляторную функцию, но и оказывает опиатоподобное, анальгезирующее действие. Введение САП животным вызывало избирательное подавление ноцицептивной (болевой) чувствительности, что характерно для действия опиатов. Данный эффект реализуется, по-видимому, в результате связывания медиатора с опиатными рецепторами.
В настоящей работе исследовали способность САП связываться с опиатными рецепторами м- и s-типов головного мозга и местами специфического связывания метэнкефалина на лимфоцитах.
Методика исследования. САП получали из надосадочной жидкости культур клеток костного мозга мышей-гибридов (СВАхС57В1) F1 описанным ранее способом. Дозу САП оценивали по количеству входящего в его состав белка, определяемого по методу Лоури. Для анализа способности САП взаимодействовать с опиатными рецепторами головного мозга крыс и местами специфического связывания метэнкефалина на лимфоцитах использовали метод конкурентного замещения 3Н-морфина и метэнкефалина препаратом САП.
В работе использовали крыс-самок Вистар массой 200—250 г. Мембранную фракцию клеток головного мозга получали модифицированным методом Симантова: крысу декапитировали, извлекали на холоду головной мозг, выделяли из него стриатум, средний и промежуточный мозг, гомогенизировали в 50 объемах холодного буфера (50 мМ трис-НС1 рН 7,7) в гомогенизаторе стекло — тефлон. Полученную суспензию центрифугировали при 30 000 g в течение 20 мин при 4°С. Осадок суспендировали в первоначальном объеме того же буфера и выдерживали в течение 40 мин при 37°С. Затем суспензию рецентрифугировали в тех же условиях. Полученный осадок ресуспендировали в 50 мМ трис-НС1 рН 7,7 (25 °С), содержащем 0,1 % человеческого сывороточного альбумина (ЧСА). ЧСА вводили в среду инкубации для снятия возможного неспецифического эффекта белков, вносимых в пробу в составе САП, на связывание опиатов. Реакционная смесь объемом 1 мл содержала 0,7 мл мембранной суспензии белка, 4 нМ меченого морфина или 4 нМ меченого метэнкефалина, 50 мкг бацитрацина. Для вытеснения метки препаратом САП были использованы его концентрации от 1 мкг/мл до 1 мг/мл. При исследовании взаимодействия САП с местами специфического связывания 3Н-мет-эн-кефалина лимфоцитами использовали периферическую кровь здоровых доноров в возрасте 20—40 лет. Лимфоциты выделяли в градиенте фиколла — верографина, дважды отмывали 50 мМ трис-НС1 рН 7,4. Радиорецепторное исследование взаимодействия 3Н-мет-энкефа-лина с лимфоцитами проводили, как описано ранее. Величину специфического связывания метки определяли как разницу в связывании 3Н-мет-энкефалина или 3Н-морфина в присутствии и в отсутствие в реакционной смеси 2 мкМ соответственно метэнкефалина или морфина.
Рис. 1. Сравнительная способность морфина и САП вытеснять 3Н-морфин из опиатных рецепторов головного мозга крыс. а — морфин, б — САП с бацитрацином, в — САП без бацитрацина. По оси абсцисс - концентрация морфина (в мкМ) и САП (в мг/мл) в реакционной смеси, по оси ординат — уровень специфического связывания 3Н-морфина с опиатными рецепторами головного мозга крыс (в % от контроля). Каждая величина - средняя 4 определений, различающихся между собой менее чем на 10 %.
Рис. 2. Вытеснение 3Н-мет-энкефалина из опиатных рецепторов головного мозга крыс немеченым метэнкефалином (а) и САП (б). По оси абсцисс - концентрация метэнкефалина (в мкМ) и САП (в мг/мл); по оси ординат — уровень специфического связывания 3Н-мет-энкефалина с опиатными рецепторами головного мозга крыс (в % от контроля). Реакционная смесь содержала бацитрацин (50 мкг/мл). Каждая величина — средняя 4 определений, различающихся между собой менее чем на 10 %.
Рис. 3. Вытеснение 3Н-мет-энкефалина из мест специфического связывания на лимфоцитах немеченым метэнкефалином (а) и САП (б). По оси абсцисс - концентрация метэнкефалина (в мкМ) и САП (в мг/мл); по оси ординат - уровень специфического связывания 3Н-мет-энкефалина на лимфоцитах (в % от контроля). Реакционная смесь содержала бацитрацин (50 мг/мл). Каждая величина - средняя 3 определений, различающихся между собой менее чем на 10 %.
Разделение связанной и несвязанной меток проводили путем быстрой фильтрации (не более 10 с на пробу) через стеклянные фильтры GF/B (фирма «Whatman», США). При исследовании взаимодействия меченых опиатов с мембранами головного мозга крыс фильтры промывали 7,5 мл холодного 50 мМ трис-НС1-буфера рН 7,7, при работе с лимфоцитами — 7 мл холодного 50 мМ трис-НС1-буфера рН 7.4. Фильтры переносили во флаконы с 8 мл сцинтиллятора «Lipoluma» (фирма «Lumac», Швейцария) для измерения радиоактивности, выдерживали там 12 ч, уровень радиоактивности определяли на счетчике «Mini Beta» (фирма LKB, Швеция).
В работе использовали следующие реактивы:
3Н-мет-энкефалин (39 Ки/ммоль, фирма «Amersham», Англия), 3Н-мор-фин (22 Ки/ммоль, той же фирмы), метэнкефалин (фирма «Miles», США), морфин - аптечный препарат, бацитрацин (53 500 МЕ/г, фирма «Sigma», США), трис (фирма «Serva», ФРГ), фиколл (фирма «Pharmacia», Швеция) верографин (фирма «Spofa», ЧССР), человеческий сывороточный альбумин (фирма «Reanal», Венгрия).
Результаты исследования: Концентрация САП, вызывающая 50 % вытеснение метки (3Н-морфин) из мест специфического связывания с рецепторами головного мозга (ЕС50 — эффективная концентрация) в среде инкубации, содержащей ингибитор протеаз бацитрацин, равна 96 мкг/мл (рис. 1, б), в то время как в среде без бацитрацина — 190 мкг/мл (рис. 1, 0). Из этого следует, что САП обладает способностью специфически связываться с опиатными рецепторами головного мозга крыс. Можно также предположить, что эта способность обеспечивается лигандами пептидной природы.
На рис. 2 показана сравнительная способность метэнкефалина и САП конкурентно вытеснять 3Н-мет-энкефа-лин из опиатных рецепторов головного мозга крыс. Как видно из рис. 2, ЕС50 САП равна 3,2 мкг/мл. Сравнение величин ЕС50 САП, полученных при вытеснении из опиатных рецепторов морфина (см. рис. 1, б) и метэнкефалина (см. рис. 2, б), позволяет сделать вывод о большей способности опиатов, входящих в состав САП, взаимодействовать с опиатными рецепторами 6-типа, чем д-типа.
На рис. 3 продемонстрирована способность метэнкефалина и САП конкурентно вытеснять 3Н-мет-энкефалин из мест специфического связывания этого лиганда на лимфоцитах человека. В данных экспериментах ЕС50 для САП равна 18 мкг/мл (см. рис. 3, 6).
Результаты проведенного исследования демонстрируют способность САП специфически связываться с опиатными рецепторами и свидетельствуют о наличии в САП опиатной активности, что согласуется с полученными ранее данными об анальгезирующем действии этого медиатора.
В настоящее время имеются отдельные экспериментальные факты, указывающие на взаимосвязь между иммунной и нервной системами. Так, на иммунокомпетентных клетках обнаружены рецепторы к опиатным пептидам: b-эндорфину, метэнкефалину. В то же время показано, что в составе выделяемого лимфоцитами интерферона содержатся вещества, по своим свойствам и структуре сходные с АКТГ и b-эндорфином.
Таким образом, взаимодействие между иммунной и нервной системами осуществляется при участии растворимых медиаторов. Выявление опиатной активности САП позволяет предположить его возможную роль в передаче информации от иммунной системы к нервной и открывает перспективу поиска опиатоподобных веществ среди различных лимфокинов.